引言

纳米医学的靶向效应通常依赖于纳米颗粒（Nanoparticles, NPs）跨越细胞膜并抵达细胞内靶点的能力。为实现高效递送，纳米颗粒需与细胞膜上的蛋白质发生相互作用，从而启动内吞过程。尽管功能化配体与受体之间的作用已被广泛研究，近年来的证据表明，邻近受体的辅助膜蛋白同样在内吞及其下游信号调控中扮演关键角色。例如，血管内皮生长因子与其受体结合时，神经纤维蛋白和钙黏蛋白等辅助受体的参与可导致信号通路产生显著差异。因此，系统解析纳米颗粒–细胞界面蛋白质组对于预测其细胞摄取行为及功能性响应具有重要意义。

传统研究方法，如基于磁性纳米颗粒的囊泡分离、NP处理后的全细胞蛋白质组学分析，或过氧化物酶介导的全细胞表面生物素化标记，虽可部分揭示与NP相关的膜蛋白，却因缺乏时空特异性，难以精确捕捉NP结合位点附近的蛋白互作网络。本工作发展了一种基于“邻近标记技术”的高分辨蛋白质组学分析方法，揭示了不同巨饱饮作用亚型相关膜蛋白组的异同，为面向精准医学的靶向纳米药物设计中“疾病生物标记物筛选”环节提供了有效策略。

1、基于过氧化物酶-纳米材料偶联物介导的邻近标记技术

为解决上述难题，松山湖材料实验室纳米生物材料团队的魏裕双副研究员、元冰研究员，和来自明尼苏达大学药学院的庞宏博教授合作，将辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）共价连接至多种纳米颗粒及配体（X-HRP），包括TAT肽修饰金纳米颗粒（T-Au）、RPAR肽修饰金纳米颗粒（R-Au）、转铁蛋白（Tf）、Trastuzumab、脂质纳米颗粒（LNP）、Abraxane（Abx）及70 kDa dextran（Dex）等。TAT和RPAR肽分别代表典型的细胞穿透肽（CPP）和肿瘤穿透肽，通过受体依赖型巨胞饮作用（macropinocytosis, MP）进入细胞，而Dex则作为传统非受体依赖型MP示踪物。

在HRP和H₂O₂存在的条件下，加入生物素-酚类底物（BP或膜不可透性BxxP）后，HRP催化生成的生物素-酚自由基能够在1–20 nm范围内共价标记邻近蛋白质。结合SILAC稳定同位素标记与质谱分析，研究团队有效去除了非特异性标记蛋白，从而获得纳米颗粒–细胞界面特异性的蛋白质组信息。进一步通过siRNA沉默或CRISPR-Cas9敲低候选蛋白，对其在纳米颗粒内吞中的功能进行了验证。

图1. X-HRP介导的邻近标记示意图。X-HRP利用H₂O₂催化生成生物素-酚（BP/BxxP）自由基，标记相互作用位点邻近蛋白质富含电子的氨基酸残基。

2、X-HRP邻近标记揭示巨胞饮亚型蛋白质组差异

实验结果表明，HRP的共价连接对纳米颗粒的粒径、表面电位及细胞摄取效率影响极小，且HRP仍保持高酶活，可实现高效的邻近标记。使用膜不透性BxxP可特异性标记细胞表面蛋白，避免胞内背景信号干扰。SILAC质谱分析显示，受体依赖性MP（以T-Au-HRP为示踪）富集到211种独特蛋白，而传统MP（Dex-HRP示踪）仅富集73种，两者共同蛋白仅23种，表明不同MP类型在蛋白质组层面具有显著区别。功能注释提示，T-Au特异性蛋白多与信号转导、细胞运动与迁移相关，而Dex相关蛋白则更多参与细胞黏附过程，反映出不同MP亚型在内吞机制上存在功能分化。

图2. T-Au和Dex相关巨胞饮作用蛋白组学差异

功能实验进一步验证了CDH1（E-cadherin）作为关键调控因子：尽管CDH1并非TAT肽的直接受体，其敲除显著抑制了TAT-NP的摄取，并对Dex和BSA等传统MP示踪物的内吞也产生部分影响。电镜观察显示CDH1缺失并不改变囊泡尺寸，但导致每个囊泡内纳米颗粒数量明显减少，表明其在颗粒–受体复合物稳定、膜皱褶形成及内吞囊泡生成中起辅助作用。CDH1在内吞囊泡中随时间动态累积，进一步支持其在MP过程中的功能性角色。

图3. CDH1参与调控巨胞饮作用

此外，DAG1与CEACAM1也被鉴定为调控纳米颗粒摄取的关键膜蛋白。DAG1主要影响受体依赖性TAT-NP内吞，而CEACAM1则同时参与受体依赖性和传统MP过程。这些结果提示，纳米颗粒的内吞不仅依赖于核心配体–受体识别，还受到一系列辅助膜蛋白的精密调控，这些蛋白可能参与膜动力学调制、囊泡闭合及后续运输等多个环节。

3、研究亮点与意义

撰稿：纳米生物材料团队